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PCR入門知識

時間:2019-06-28    點擊: 次    來源:信和翔公司    作者:佚名 - 小 + 大

隨著科技日新月異的發展,市場上出現了形形色色的成品試劑盒,諸如qPCR、ELISA、生物芯片、生化、化學發光等等。涵蓋了醫療、食品安全及畜牧等諸多行業。在給實驗人員帶來極大便利的同時,大大降低了檢測實驗對人員要求的準入門檻。

本章節僅以qPCR在畜牧行業的應用,簡單的介紹一下作為一名畜牧行業的一線實驗人員所須具備的實驗意識。

1.試劑經凍融后的取用。PCR試劑大多需-20℃保存,試劑復融后在使用前需要先渦旋震蕩然后低速離心。因為經過凍存復融后,試劑內的溶質可能會出現分布不均一的情況,所以使用前需渦旋震蕩,保證試劑的均一。在凍存的時候,因擺放的原因可能會造成試劑吸附在所在容器的側壁甚至是封口帽處,如不經離心一是可能取液時無法取到所需液體;二是若液體吸附在封口帽處,在開封時會造成液體的飛濺和對試劑的污染。

2.抗凝采血管的選擇。若檢測樣本為抗凝全血,需使用紫色帽(EDTA)的采血管采血。不能使用綠色帽(肝素)的采血管采血。肝素對Taq 酶具有強抑制的特性,會抑制PCR反應的進行。

3.實驗耗材取用的次序。在實驗前將本次實驗所需的槍頭、離心管、PCR反應管等準備好,嚴禁在實驗的過程中再去包裝袋中取用上述耗材。實驗前取用,此時的手套相對干凈;實驗中取用,則大大增加了耗材整體被污染的風險。

4.移液器槍頭的安裝。移液器安裝槍頭時,移液器對準槍頭尾部垂直向下輕壓,再左右輕旋手腕(移液器一直保持垂直狀態);嚴禁通過移液器與槍頭的反復撞擊來安裝槍頭(反復撞擊會對移液器造成較大磨損,容易出現氣密性不好、漏氣的情況,最終造成取液量和加液量的不準)。


5.加液的順序和注意事項。向大體積的反應體系中添加小體積的液體,槍尖需沒入液面之后排出液體,然后將槍尖移至距排出液體最遠處再吸取液體排至第一次排出液體處,重復3次(不能在原處潤洗槍頭,液體排出槍頭后會在液體排出處形成局部的大濃度環境,潤洗效果不佳),保證小體積液體最大程度的轉入大體積的反應體系中,減小在移液器槍頭內的殘留。(舉例:向PCR反應液添加反應模板<待檢核酸>)由于取液量少,一定要注意a取液是否足量取到b加液是否足量加入。嚴禁在反應體系的液面之上貼壁添加液體!容易出現液體未添加進下面反應體系的情況,哪怕后續有瞬時離心的操作。


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