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我國首例非洲豬瘟的確診

時間:2018-08-07    點擊: 次    來源:中國動物衛生與流行病學中心    作者:王清華等 - 小 + 大

摘要 :近日,遼寧省沈陽市一養豬戶飼養的豬陸續發生不明原因死亡,病死豬剖檢發現脾臟異常腫大,疑似非洲豬瘟病毒感染。經國家外來動物疫病研究中心檢測,確診為非洲豬瘟病毒核酸陽性,B646L/p72 基因序列417 個堿基與俄羅斯毒株 100% 匹配, 與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株(Georgia 2007)屬于同一進化分支。這是我國發現的首例非洲豬瘟,疫情來源有待進一步調查。

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病,臨床上以高熱、網狀內皮系統出血和高死亡率為特征,易感豬群的病死率高達 100%。鑒于該病的嚴重危害性,世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病,我國將其列為一類動物疫病。ASFV 不感染人,對人的健康不構成威脅。目前,針對 ASF 防控,尚無有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日,國家外來動物疫病研究中心接到遼寧省沈陽市沈北區發現 ASF 臨床可疑病例的報告(圖 1)。截至 8 月 1 日,發病豬場累計死亡 47 頭,對剛病死的 2 頭豬剖檢發現:脾臟極度腫大,嚴重梗死,質脆易碎,其中一頭豬脾腫大至少 10 倍,一頭豬脾腫大 5~7 倍;肺出血、質硬,有間質性肺炎變化;下頜淋巴結、腸系膜淋巴結出血,切面呈大理石樣變;胃漿膜面彌漫性出血;腎腫脹明顯、色淡,未見出血點;扁桃體見陳舊性出血,符合 ASF 癥狀。國家外來動物疫病研究中心立即開展病原學檢測,證實本次疫情由ASFV引起。這是我國歷史上的首次 ASF 發病記錄。

圖1  發病場地位置

1 材料與方法

1.1 病料 

病原學樣品:分別來源于 2 頭病死豬的剖檢病料,包括全血、脾臟、淋巴結、扁桃體;30 頭臨床健康豬的全血。血清樣品:2 頭病死豬及同群 30 頭臨床健康豬血清。 

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的組織勻漿管(Roche)中,加入600 μL PBS 緩沖液,再加入剪碎的組織樣品約 30 mg,使用 HyBaid RiboLyser 組織勻漿機進行勻漿處理。取 200 μL 組織勻漿液和全血,分別使用病毒 DNA 提取試劑盒提取 DNA。最后將提取的核酸于 ?80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 熒光定量 PCR

依據文獻報道,用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的熒光定量 PCR 方法進行 ASFV p72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 king-s/king-a,TaqMan 探針為 ASFVP,同時以本試驗室合成的質粒 DNA 標準品為陽性對照。

1.4 普通 PCR

依據文獻報道,用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的 PCR 方法進行 ASFV p72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 PPA1/PPA2,產物長度為 257 bp,同時以本試驗室合成的質粒DNA 標準品為陽性對照。

1.5 測序片段 PCR 擴增

依據文獻報道,合成擴增 p72 基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U)。引物由上海生工生物技術有限公司合成。采用高保真的 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 擴增 B646L/p72 基因片段,預期擴增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反應體系 為:2X Phusion Master Mix 25 μL,p72-D(10 μmol/L) 和 p72-U(10 μmol/L) 各 2 μL, 模板DNA 2 μL,用滅菌水補齊體積至 50 μL。PCR 反應程序為:98 ℃預變性 30 s;然后進行 35 個 PCR 循環(98 ℃ 10 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s);最后 72 ℃ 10 min。

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