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瓊脂擴散試驗操作方法

時間:2009-12-23    點擊: 次    來源:陽光畜牧網    作者:陽光畜牧網 - 小 + 大

    瓊脂擴散試驗,是根據沉淀試驗的原理,抗原和抗體可在瓊脂凝膠中擴散,并由近及遠形成濃度梯度,當抗原、抗體的特異性互相對應時,它們在瓊脂基質中適合比例下相遇,便可相互結合,形成抗原-抗體的結合物,分子量相應增加,顆粒變大,故在瓊脂凝膠中不再擴散,在抗原、抗體比例較適合的位置上形成白色可見的沉淀線,此種沉淀反應,稱為瓊脂免疫擴散試驗,簡稱"瓊擴"。本法可用已知抗原測定未知抗體,反之亦然。在豬病的實驗室診斷中,常用于豬偽狂犬病的抗體檢測,也曾有用此法檢查豬瘟、豬水皰病和豬痘等疾病的報道。現以檢測偽狂犬病的抗體為例,將其操作方法介紹如下。
  (1)材料 偽狂犬病標準瓊擴抗原,陽性血清,陰性血清, 待檢血清(56℃滅能30分鐘),生理鹽水,打孔器,微量移液器,培養皿,瓊擴瓊脂(配制方法:含有0.1%石炭酸的磷酸緩沖鹽水,加入1%的優質瓊脂,在沸水中融化均勻,若有雜質, 須用紗布過濾,然后分裝于鹽水瓶內,保存備用)。
  (2)操作
  ①澆瓊脂板和打孔 將已融化的瓊脂趁熱倒入平皿,制成3毫米厚的瓊脂板,待凝固后進行打孔。一組共7個孔,中間l孔,周圍6孔。用打孔器打孔,剔出孔內的瓊脂,然后將瓊脂板在酒精燈上來回過 2-3次,使瓊脂與玻板之間的空隙封閉。
  ②向孔內加樣 中央孔加抗原,外周孔第1,5孔加陽性和陰性血清作對照,第2,3,4,6孔加待檢血清。將加完樣的瓊脂平皿合上蓋子,置37℃恒溫箱擴散24-36個小時,然后判定結果。
  ③結果判定 首先檢查標準陽性血清孔和抗原孔之間是否出現明顯的致密的白色沉淀線5的,而陰性孔則不出現,只有在對照組出現正確結果的前題下,被檢孔才可參照標準判定。
  ④注意事項
  第一,瓊擴所用的瓊脂必須是優質的瓊脂粉,若用普通的瓊脂條,應事先進行凈化精制。精制的簡易方法是:取條狀瓊脂24克,加蒸餾水1 000毫升,在沸水中融化,趁熱倒入搪瓷盤中,待冷卻后切成1平方厘米大小的瓊脂塊,用蒸餾水或無離子水浸泡2-3天,每天換水4-5次,然后將處理好的瓊脂塊隔水融化,加入0.1%石炭酸磷酸緩沖鹽水,配成1%瓊脂。
  第二,制備瓊脂板應在水平臺上進行,防止產生厚薄不勻。板的厚度要求一致(7.5厘米的平皿,用15毫升瓊脂液)。 澆制時防止產生氣泡。平皿澆制的瓊脂板在4℃冰箱內可保存15天。
  第三,打孔的孔徑、孔距力求準確、合適。
  第四,加滴孔中的抗原和血清時,孔內必須加滿而又不能外溢。加樣時不能帶進小氣泡。

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